UA-82266412-1

Prosedur Penggunaan Plant Preservative Mixture (PPM) Pada Media Kultur Jaringan Untuk Peningkatan Kualitas dan Kuantitas Tanaman Kultur Jaringan

Tanaman Kultur Jaringan dengan Plant Preservative Mixture Kultur jaringan tanaman (Picture from http://www.scind.org)

Kultur jaringan dikenal juga dengan sebutan tissue culture. Kultur jaringan berasal dari kata kultur  yang artinya budidaya dan jaringan yang artinya sekelompok sel yg mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Berdasarkan asal kata tersebut maka arti dari kultur jaringan adalah membudidayakan jaringan tanaman menjadi tanaman baru yang mempunyai sifat sama dengan induknya. Kultur Jaringan diartikan pula dengan memelihara & menumbuhkan organ tanaman (embrio, tunas, bunga dsb) atau jaringan tanaman (sel, kalus, protoplast) pada kondisi aseptik. (https://www.pintarbiologi.com). Salah satu cara untuk peningkatan kualitas dan kuantitas tanaman kultur jaringan yaitu dengan penggunaan Plant Preservative Mixture (PPM). Plant Preservative Mixture (PPM) merupakan preservative/biosida spectrum luas yang efektif untuk mencegah atau menurunkan kontaminasi mikroba pada kultur jaringan tanaman. Pada dosis optimum PPM sangat efektif dan tidak mempengaruhi vitro germination, ploriferasi kalus dan regenerasi kalus. Plant Preservative Mixture (PPM) ini mengandung zat aktif yang terdiri dari :

5-Chloro-2 methyl-3-(CH) – isothiazolone 0,1350%
2-methyl-3(H)-isothiazolone 0,0412%

hasil kultur jaringanKultur Jaringan (Dokumentasi Pribadi)

Prosedur yang dijelaskan di bawah ini merupakan prosedur secara umum. Sedikit modifikasi mungkin diperlukan untuk spesies tanaman tertentu sebelum pemakaian untuk media kultur jaringan. PPM secara signifikan dapat menyederhanakan pekerjaan kultur jaringan dengan prosedur kerja sebagai berikut:
1. Media kultur jaringan yang mengandung PPM dapat dituangkan diluar laminar yang terpapar aliran udara. Pelat yang mengandung media harus segera ditutup setelah terjadi pembekuan agar. Pengeluaran media yang dilakukan dengan pompa, disarankan untuk melewatkan air panas seperti pada autoclave melalui selang sebelum dan setelah penuangan media.

2. Media cair sensitif panas atau stabil panas yang mengandung PPM tidak memerlukan sterilisasi dengan filter milipore atau autoclave. Hal tersebut dilakukan jika media akan disimpan dalam wadah steril dan larutan stok tidak terkontaminasi. Dalam media diperkaya yang mengandung 200 mg/L atau lebih asam amino atau protein, dianjurkan menyaring media dengan PPM.

3. Jika bekerja dalam laminar, peralatan (pisau bedah/forceps) tidak memelukan nyala api. Peralatan tersebut harus secara periodik dicelupkan dalam alkohol 70%. Laminar tidak memerlukan sertifikasi dan pengerjaan dapat dilakukan juga diluar laminar pada permukaan yang bersih untuk jangka waktu tidak lebih dari 1 jam.

4. PPM adalah cairan larutan asam (pH 3.8). PPM harus disimpan pada suhu 4oC. Pada dosis yang dianjurkan yaitu 0.05-0.2% (v/v), PPM dapat ditambahkan ke media sebelum dan sesudah proses autoclave untuk mencegah kontaminasi udara dan endogen pada kepadatan inokulum yang rendah.

5. PPM kurang efektif jika diterapkan pada bakteri atau spora jamur dengan kepadatan tinggi yang ditemukan secara teratur pada kulit biji. Untuk perkecambahan secara in vitro, secara konvensional permukaan benih harus disterilkan dengan pemutih yang terdaftar oleh EPA. Oleh karena itu, dengan adanya PPM (dalam perkecambahan), benih dapat dibilas dibawah air keran dalam saringan non steril dan dibiarkan kering sebaiknya dalam laminar. Jika ujung alat telah menyentuh bakteri aktif, kultur jamur, atau yang diduga kontaminan, maka alat tersebut harus disterilkan dengan autoclave atau menggunakan elemen pemanas listrik.

Plant Preservative Mixture (PPM) untuk kultur jaringanPlant Preservative Mixture (PPM)

6. Tingkat Dosis Secara Umum
Dengan pengecualian dari kontaminan endogen, tentang dosis yang dianjurkan adalah 0.05-0.2% (untuk poliferasi kalus, organogenesis, dan embriogenesis, kisaran dosis yang dianjurkan adalah 0.05-0.075%). Tambahkan PPM pada media sebelum atau setelah proses autoclave untuk mencegah kontaminasi udara dan endogen pada kepadatan inokulum rendah atau bakteri dengan pertumbuhan yang lambat. Untuk menghilangkan kontaminasi endogen dengan kepadatan yang lebih tinggi, dibutuhkan dosis PPM yang lebih tinggi.

7. Kontaminasi Endogen
(A) Untuk eksplan: secara lembut dan rutin, kocok/aduk eksplan dengan panjang 1 cm. eksplan yang panjang/lebih pendek dikocok selama 4-12 jam dalam larutan 4-5% PPM yang dilengkapi dengan media MS garam basal pekat tanpa pengukuran pH dan penambahan tween 20. Tanpa dilakukan pembilasan, masukkan ke dalam media yang telah dilengkapi 0.05-0.1% PPM untuk tanaman herbal dan 0.2% PPM untuk tanaman berkayu.
(B) Untuk umbi-umbian, kocok/ aduk sampel umbi dalam pemutih, bilas dengan air (bisa dilakukan pada kondisis nonsteril). Iris umbi menjadi bentuk irisan yang tipis kemudian dikocok selama 12-24 jam dalam larutan 4-5% PPM yang dilengkapi dengan media MS garam basal pekat tanpa pengukuran pH dan penambahan tween 20. Tanpa pembilasan, masukkan irisan umbi tadi ke dalam media yang mengandung 0.1-0.2% PPM .

8. Jika dengan prosedur yang dijelaskan tadi, hasilnya tidak memuaskan (terutama untuk ekspalan yang tebal, tingkat kepadatan eksplan yang tinggi, dan benih), rekomendasi prosedur dibawah ini dapat dilakukan:
(A) Kocok/aduk eksplan dalam air( 1 jam untuk jaringan tanaman lunak dan 2 jam untuk jaringan tanaman keras)
(B) Kocok/aduk eksplan dalam 50% PPM yang dilengkapi dengan media MS garam basal pekat tanpa pengukuran pH dan penambahan tween 20 selama 5-10 menit.
(C) Tanpa pembilasan, masukkan eksplan ke dalam media. Dalam hal kontaminasi jamur, penambahan PPM ke dalam media adalah suatu pilihan. Namun untuk kontaminasi bakteri atau campuran, penambahan 0.05-0.2% PPM ke dalam media di bulan pertama sangat penting. Jangan membuang tanaman yang teroksidasi dalam tingkat yang tinggi karena 50% bagian eksplan akan pulih dalam 4-6 minggu.

gerbera-tissue-culture-plants-2226422Tanaman Sayuran Hasil Kultur Jaringan (Picture from https://2.wlimg.com)

9. Untuk Dekontaminasi Kontaminan Tanaman dalam Kultur ( Pemeliharaan dan Pengobatan)
catatan: kultur harus tidak terlihat terkontaminasi lebih dari 1 minggu
(A) Bersihkan bahan mekanis menggunakan sikat gigi yang lembut dibawah aliran keran, lalu kocok/aduk dalam larutan PPM ( diencerkan dalam air steril) selama 5-15 menit. Untuk kontaminasi bakteri/campuran, disarankan untuk menurunkan pH larutan pada kisaran 2.8-3.2 dengan mencampurkan 1:1 PPM pekat (100%) dengan 0.6 gram/liter larutan asam sitrat ( menggunakan air steril).
(B) Tanpa pembilasan, masukkan ke dalam media dengan 0.05-0.2% PPM setidaknya selama 1 bulan. Jauhkan kultur dari cahaya intensitas tinggi untuk 10 hari pertama. Seperti yang telah dijelaskan, jangan membuang eksplan yang teroksidasi. Tunggu 4-6 minggu, sekitar 50% bagian eksplan akan pulih. Dalam beberapa kasus, spora jamur atau bakteri yang terletak jauh dalam eksplan adalah diluar jangkauan PPM. Dalam kasus tersebut dan setelah perendaman dalam air dengan periode tertentu dapat diantisipasi dengan cara: iris eksplan memanjang dan kemudian dikocok /aduk dalam larutan PPM 50% selama 15 menit.

10. Untuk menghilangkan agrobakterium
Setelah co-cultivasi, bilas permukaan daun dengan air. Celupkan seluruh permukaan daun terinfeksi dalam larutan 100% PPM (dilengkapi dengan garam basal pekat) selama kurang lebih 2 menit. Lap permukaan daun diantara 2 handuk bahan kertas steril dan tempatkan dalam media yang dilengkapai antibiotik dosis tinggi yang biasa digunakan. Setelah 3 minggu, pindahkan ke dalam media dengan konsentrasi PPM 0.05-0.075%.

{ Leave a Reply ? }

  1. Syaiful

    thanks for sharing

  2. Mega Setiani

    thank you for sharing, visit our web http://ittelkom-pwt.ac.id

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *